qPCR（Quantitative real-time PCR）實(shí)驗中，模板質(zhì)量、引物設計、qPCR反應體系、程序設置，均是影響實(shí)驗成功的重要因素。其中，qPCR的引物設計尤為重要，決定了qPCR擴增效率和擴增產(chǎn)物的特異性，引物設計都有哪些原則和要點(diǎn)，一起來(lái)了解一下吧！

qPCR引物設計原則

1. 引物長(cháng)度一般在18~30 nt之間，擴增產(chǎn)物長(cháng)度盡量控制在 80~200 bp之間。

引物設計太短會(huì )導致非特異擴增，太長(cháng)則容易形成二級結構(如發(fā)夾結構)。擴增產(chǎn)物太長(cháng)會(huì )影響到PCR擴增效率。

2. 引物GC含量控制在40%~60%之間，正反向引物Tm值介于55~65℃之間，正反引物的Tm差值不超過(guò)3℃。

3. 引物3′端盡量避免選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時(shí)，不同堿基引發(fā)合成效率存在著(zhù)很大的差異，當末位堿基為A時(shí)，即使在錯配的情況下，也能引發(fā)鏈合成，而當末位為T(mén)時(shí)，錯配引發(fā)效率大大降低。

4. 單個(gè)堿基重復≤3個(gè)。

引物中四種堿基的分布最好是隨機的，尤其3′端避免超過(guò)3個(gè)連續的G或C，因為3個(gè)以上連續的G或C容易在GC富集序列區產(chǎn)生錯誤引發(fā)。

5. 引物設計區域應避開(kāi)復雜二級結構。

擴增產(chǎn)物單鏈形成二級結構會(huì )影響PCR順利進(jìn)行，可用軟件（比如RNAstructure）預測靶序列是否存在二級結構，盡量避開(kāi)該區域設計引物。

6. 引物自身和引物之間應盡量避免堿基連續互補。

引物自身和引物之間不能有連續4個(gè)堿基的互補，引物自身存在互補序列會(huì )形成發(fā)夾結構而影響引物與模板的復性結合，而引物之間互補會(huì )產(chǎn)生引物二聚體而降低PCR效率甚至影響定量準確性。如果引物二聚體及發(fā)夾結構不可避免，應盡量使其△G值不要過(guò)高（應小于4.5kcal/mol）。

7. 引物擴增的是目標特異產(chǎn)物。

qPCR檢測最終目的是了解目的基因的豐度，如果出現非特異擴增，定量會(huì )不準確。所以設計好引物后需要在序列數據庫中比對產(chǎn)物的特異性。


 

qPCR引物設計方法

以上我們了解了qPCR引物設計原則，看上去內容多而復雜，在實(shí)際應用中，我們可借助生物學(xué)軟件完成qPCR引物設計。常用的軟件有Primer-BLAST、Primer3、Primer Premier、Primer Express、Beacon Designer、Oligo 7等，NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST無(wú)需下載軟件，可以直接打開(kāi)網(wǎng)頁(yè)設計引物，除了常規引物參數設置外，還可以設置跨越內含子引物和檢測引物的特異性，應用非常廣泛。接下來(lái)我們通過(guò)以下三步來(lái)學(xué)習利用Primer-BLAST成功設計qPCR引物。

01 查找目的基因序列

qPCR方法可以檢測基因組DNA含量，也可以檢測基因轉錄水平的表達量（RNA的含量），后者需要先提取組織部位的RNA，進(jìn)行反轉錄得到cDNA，再做檢測。所以設計引物之前需要明確實(shí)驗目的，明確模板是DNA還是cDNA，不同類(lèi)型模板，需要下載的序列是不同的?；虮磉_量的檢測是目前qPCR的主要應用方向，因此今天以基因表達量分析為例介紹qPCR引物的設計方法。

以水稻產(chǎn)量基因GW2為例設計引物，在NCBI數據庫主頁(yè)Gene數據庫中搜索GW2，獲得該基因mRNA的Accession號和FASTA序列。

02 設計引物

打開(kāi)NCBI的Primer-BLAST頁(yè)面，出現PCR Template，Primer Parameters，Exon/intron selection，Primer Pair Specificity Checking Parameters四種參數設置。

① PCR Template是針對模板的設置，設計人員可以選擇輸入accession號、FASTA序列或者上傳FASTA序列文件等方式導入模板序列，優(yōu)先輸入accession號，這種方式在輸出頁(yè)面可以直觀(guān)地展現引物對應外顯子的位置。Range可以指出引物位置范圍，如果我們只想在CDS區設計引物，可以把范圍直接鎖定在CDS區，此處未填寫(xiě)代表全長(cháng)序列都參與設計。

② Primer Parameters是針對引物參數的設置，本次為新引物設計，無(wú)需填寫(xiě)引物序列。PCR產(chǎn)物大小建議設置為80~200 bp，如果模板復雜較難設置出合適的引物，產(chǎn)物大小可適當延長(cháng)至300 bp。輸出引物對數和引物熔解溫度（Tm值）選擇默認設置即可。

③ Exon/intron selection是針對基因組序列對mRNA序列擴增結果有影響而設計的跨內含子引物設計方案，參數包括引物是否跨越內含子或者exon-exon拼接點(diǎn)，設置參數越多，可能導致設計不出合適引物。所以這欄建議選擇默認設置，后續通過(guò)引物與外顯子的相對位置來(lái)篩選引物。

④ Primer Pair Specificity Checking Parameters是針對引物特異性篩選的參數設置，數據庫和物種根據實(shí)際情況選擇，這里選擇了Refseq mRNA和水稻。有些基因可能存在可變剪切而有多個(gè)轉錄本，Allow splice variants處打勾代表可以擴增所有轉錄本（此時(shí)PCR template處應輸入mRNA序列而非accession號）。其他參數選默認設置。

⑤ 點(diǎn)擊Get Primers，即自動(dòng)生成合適引物。我們看到頁(yè)面中，Specificity of primers處描述“Primer pairs are specific to input template as no other targets were found in selected database: Refseq mRNA (Organism limited to Oryza sativa Japonica Group)"，代表10對引物均可特異性結合靶序列，我們可以選擇不同區域的兩對跨內含子的引物進(jìn)行后續預實(shí)驗驗證。

03 引物預實(shí)驗驗證

軟件設計的引物在理論上是可用的，而實(shí)際實(shí)驗中，會(huì )有很多未知的因素而無(wú)法得到理想結果，所以強烈建議用預實(shí)驗驗證引物的有效性。

cDNA原液以4為倍數進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)玫?~6個(gè)梯度，同時(shí)用預選的引物對進(jìn)行qPCR擴增（要設置NTC）。結束后觀(guān)察熔解曲線(xiàn)的特異性和標準曲線(xiàn)的擴增效率，如果熔解曲線(xiàn)單一、尖銳，初步判斷產(chǎn)物是特異的，擴增效率要介于90%~110%之間，越接近100%，定量越準確。滿(mǎn)足這些條件后，建議把PCR產(chǎn)物（謹防污染）做一代測序驗證序列的特異性。最后，根據實(shí)驗需要選擇合適的qPCR引物用于后續正式實(shí)驗即可。

補充Tips：

1. 這里介紹了一般的qPCR引物設計流程，如果仍沒(méi)有篩選到合適的引物，需要針對性的調整參數，必要時(shí)需要在A(yíng)dvanced parameters調整參數以設計到合適的引物。

2. 在表達量研究實(shí)驗中，基因組殘留對后續定量結果的影響是必須考慮的因素，可以有兩種方式來(lái)解決此問(wèn)題，其中一種方式在引物設計里介紹過(guò)，即設計跨越內含子的引物使基因組序列無(wú)法被擴增，另一種方式是在RNA提取過(guò)程中增加基因組去除的步驟，同時(shí)反轉錄實(shí)驗前也增加基因組去除的步驟以消除殘留DNA得到準確定量結果，后一種方式無(wú)需考慮引物設計的位置，引物設計更加簡(jiǎn)化。

相信大家get到了利用Primer-BLAST設計qPCR引物的技術(shù)要點(diǎn)，引物設計非常重要，穩定可靠、特異、靈敏的熒光定量試劑也很重要。TIANGEN的熒光定量產(chǎn)品質(zhì)量可靠、定量準確，一直以來(lái)受到廣大客戶(hù)的信賴(lài)。